【摘要】肿瘤的发生、发展和转移依赖于肿瘤组织内新生血管的形成。近10年来，大量的针对肿瘤血管形成的内源性抑制因子已在体内外实验中得到证实。在许多系统中，多数的血管生成抑制因子都能表现出很广泛的生物学功能，而其中几个抑制因子如血管抑素（angiostatin）、内皮抑素（endostatin）只对新生血管间隙的内皮细胞有特异性作用。其中一些抑制因子还能显著地抑制大多数实体瘤的生长和代谢活动。目前，已经有几种抑制因子进入了早期临床实验，并且可能为治疗肿瘤和其它的血管依赖性疾病提供新的希望。然而，具有生物学活性的血管生成抑制因子重组蛋白应用于临床仍有许多不足之处，如抑制肿瘤生长需要很高的剂量且不能彻底治愈肿瘤，大量长期应用需要较高费用等，这就需要改进的或新的方案以供临床治疗所需。
许多疾病的病理过程都涉及到血管新生，包括糖尿病性视网膜病变，银屑病，风湿性关节炎，心血管疾病和肿瘤生长。1971年，judahfolkman博士提出：“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的形成。”抑制血管新生可用于治疗实体瘤等血管依赖性疾病。本文概述血管生长抑制因子的有效性及其抑制血管生成的机制，并展望该类因子的发展方向与策略。
1血管发生及其病理学意义
血管发生是从已经存在的血管腔中长出新的毛细血管的过程。在成年哺乳动物的许多组织中，除了女性生殖系统和伤口修复等经历短暂血管新生的组织以外，脉管系统是保持静止状态的。某种组织中血管新生是否发生取决于局部促血管发生因子和血管抑制因子之间的平衡状态。虽然促血管生长因子的上调对于血管生成是必不可少的，但是同时，血管生长抑制因子水平的下调对于血管生成也同样重要。组织内血管内皮的静止状态暗示着该组织要么是缺乏促血管生成因子，要么是被血管抑制因子阻滞了。例如，在成人体内，促血管生长因子（如vegf）的高表达并不诱导新生血管的形成[1]，提示血管抑制因子在体内占优势。
启动新生血管的生长首先是内皮细胞降解局部的基底膜，改变其形态，并增生、迁移，侵袭周围的基质，形成内皮细胞管，最后构建新的血管基底膜[2]。这个复杂的过程意味着可能有一个系统性的呈级联状态的多个调控点。在这些点上，机体能在极短的时间内通过调节血管生成抑制因子或促进因子二者之间的平衡状态来影响内皮细胞的活动状态。与促血管生成因子一样，血管生成抑制因子也能够在几个方面影响血管新生：拮抗由生长因子诱导的血管新生或者抑制蛋白酶对抑制因子的酶解作用，阻滞内皮细胞的增殖、迁移和微血管形成。多数血管生成抑制因子对多种细胞如b16鼠黑色素瘤细胞和ht1080人纤维肉瘤细胞都有抑制作用，且能抑制内皮细胞生长，诱导内皮细胞凋亡；而目前发现仅有少数的抑制因子特异性地抑制新生血管内皮细胞的生长[3]。
早期研究证实几种小分子能抑制体内血管新生。例如：类固醇-肝素复合体和烟曲霉素（一种真菌来源的蛋白分子）能抑制内皮细胞生长和血管发生。血小板反应蛋白-1（tsp-1）是一种在细胞培养物内发现的内源性血管生成抑制因子。体内有些组织是缺乏血管的，因此有学者认为这类组织能过度表达血管抑制因子[4]，且这些因子多数都是蛋白质。肌钙蛋白-ⅰ（troponin-ⅰ）和色素上皮衍生因子（pigmentepithelium-derivedfactor，pedf）就是从这类无血管组织内分离出来的血管抑制因子[5,6]。而且，在动物模型中发现肿瘤组织可以产生循环性血管生成抑制因子，血管抑素（angiostatin）就是从肿瘤耐受性动物模型的血清和尿液中分离出来的与肿瘤生长相关的第一种内源性血管生成抑制因子[7]。用类似方法从肿瘤耐受动物体液中分离出来的抑制因子还有内皮抑素（endostatin）、tsp-1和serpin抗凝血酶[8,9]。
事实上，所有内源性血管生长抑制因子都能够抑制动物模型体内的肿瘤生长[10]。这个发现进一步验证了肿瘤生长是血管依赖性的。很多的血管生长抑制因子还能抑制原发和转移性肿瘤的生长并诱导其进入休眠状态[11]，且有几种抑制因子将要或已经进入了临床试验。
1974年，gimbrone等用兔眼角膜肿瘤移植实验证实了肿瘤生长对血管的依赖性：在血管长入肿瘤前，植入的肿瘤体积不会超过2－3mm3且保持休眠状态。同时植入的肿瘤能分泌高水平的促血管生长因子：vegf，fgf-1,fgf-2等。待血管长入肿瘤组织后，发现肿瘤细胞的生长速度立即从线性生长变为指数生长。而在对照组中，机械性阻断血管后，能完全阻止肿瘤生长。长入肿瘤的新生血管不仅为肿瘤细胞提供了充足的养料和氧气，还运走了肿瘤细胞产生的有毒的代谢产物。此外，内皮细胞还能通过分泌肿瘤生长因子fgf-1和fgf-2促进肿瘤生长。由此，内皮细胞和肿瘤细胞在相互促进中发生、发展，导致肿瘤细胞向远处转移。
2内源性血管生成抑制因子
长期以来，人们一直都认为血管新生取决于局部组织中促血管因子和抑血管因子的平衡状态，所以在角膜和软骨等无血管组织中，血管生成抑制因子的水平很高，尽管这些组织也可能是因为缺乏促血管生长因子去启动血管生成。1976年，r.langer等发现了一个软骨衍生的血管生成抑制因子（cartilage-derivedangiogenesisinhibitorcdi），但至今仍未研究透彻。1999年moser等分离出具有抑制血管活性的肌钙蛋白-ⅰ；同年，dawson等从角膜中分离出强效的血管生成抑制因子pedf，而且它被认为是维持角膜无血管状态的主要因子[7]。除了无血管组织外，多数有血管组织也有抑血管因子存在。tsp－1和金属蛋白酶抑制因子1，2，3(timp-1,timp-2,timp-3)在很多组织中都有分布[12]。近来又发现几种免疫细胞因子在体内外也有抑制血管生成作用，它们包括：血小板第四因子（pf4）[13]，趋化因子gro-β[14],干扰素-α,γ,白介素-12,18[15]。这些因子的发现说明免疫系统和脉管系统能够相互影响：在生理条件下，循环系统中的免疫细胞和内皮细胞可能有着非常紧密的旁分泌形式的交互作用，白细胞和淋巴细胞在沿着血管行进的过程中，可以使内皮细胞保持静默状态。具有抑制血管生成活性的还有体内天然存在的促血管生成因子拮抗剂，它们包括fgf2和vegf的可溶性受体，是受体自身基因选择性剪切后表达产生的球状蛋白。这些受体拮抗剂可在细胞外抑制其配体的生物学活性[16]。2000年，yan等从高分子激肽原（hka）中分离出d5区域并证明hka-d5区具有抑制内皮细胞增殖和诱导凋亡的生物学活性[17]。
3酶解的作用
在启动血管生成前，内皮细胞就必须侵入其周围的基底膜。这个过程一般都是内皮细胞通过酶解活动完成的。基质金属蛋白酶（mmps）在基底膜的降解中起着重要的作用[18]。所以，几乎所有的mmps抑制因子如timp-1,2,3都能抑制血管新生。已知的内源性血管生成抑制因子几乎有半数是酶解产物（表1）。这些抑制因子最显著的特征之一就是它们都是较大的蛋白质分子的一个肽段[19]。这些发现说明酶解过程可能是体内产生天然血管生成抑制因子所必不可少的一个阶段，这些从大的蛋白质分子酶解得来的抑制因子是目前研究的热门。
表1.酶解产生的血管生成抑制因子
抑制因子分子生物学特征
蛋白水解类：
angiostatin38kd纤溶酶原kringle1~4区片断
arrestin26kdⅳ型胶原α1链c末端
canstatin24kdⅳ型胶原α2链c末端
endostatin20kdⅹⅷ型胶原c末端
restin22kdⅹⅴ型胶原c末端
tumstatin28kdⅳ型胶原α3链c末端
antithrombin53~55kd抗凝血酶片断
kininostatin28kd高分子激肽原d5区
白介素及干扰素类：
il-1275kd通过ifn-γ抑制血管形成
il-18抑制fgf刺激的ec增殖和血管形成
ifn-α8-20kd淋巴细胞和吞噬细胞产生，抑制ec增殖和迁移
ifn-γ23kd的糖蛋白成纤维细胞和上皮细胞产生
其它类：
timp-1,2,3抑制基质金属蛋白酶酶解基底膜
pedf50kd视网膜色素上皮细胞产生
pf4结合肝素的28kd血小板来源因子
gro-β8kdc-x-c趋化因子
tsp-1,2450kd血小板和成纤维细胞来源的三聚体糖蛋白
肌钙蛋白-ⅰ肌钙蛋白复合物的亚单位
4血管生成抑制因子的作用机理
上述抑制因子的根本作用机制是干扰新生血管形成的各个阶段：内皮基底膜的降解；内皮细胞的增殖；内皮细胞管形成等。例如：mmps能降解血管周围的基底膜，timps能抑制mmps的这种作用[18,20]；生长因子的拮抗剂能结合游离的生长因子，抑制生长因子的促血管生长活性；angiostatin和endostatin能抑制内皮细胞的增殖和迁移并诱导凋亡[21,22]；tumstatin能与肿瘤细胞表面的cd47/iap（integrinassociatedprotein）和αⅴβ3蛋白的亚单位结合而激活粘着斑激酶（focaladhersionkinase，fak）和磷脂酰肌醇激酶3（phoshatidylinositol3-kinase，pi3）的活化，pi3活化后激活腺苷酸环化酶，从而使细胞内camp增加。后者能启动camp依赖性蛋白激酶a，此酶能延缓肿瘤细胞的增殖周期。pi3活化后也能抑制mmp基因的表达，从而使肿瘤细胞的侵袭和迁移受阻[23]。1999年moser等在分子水平上发现并分离了一种能介导angiostatin的抗血管活性的受体[24]。但是，这些血管生成抑制因子抑制内皮细胞和肿瘤细胞的精确作用机制尚需要更多的研究和证明。
5抗血管生成的治疗
至今已有20多种血管生成抑制因子进入了临床实验。ifn-2α已经成功地用于治疗小儿血管瘤[25]；vegf抗体和整合素抗体也在多种肿瘤治疗中出现了抑瘤活性[26,27]。在内源性血管生成抑制因子中，endostatin重组蛋白是唯一一个已进入ⅱ期临床实验的抑制因子。动物实验证实，endostatin在给予有效剂量（20mg•kg-1•d-1）时可完全抑制肿瘤生长，令其进入休眠状态，或者使较大的肿瘤退化到几乎不可检测的微小体积瘤细胞团[8]。从临床试验来看，用血管生成抑制因子治疗肿瘤目前仍有几个障碍需要克服：①长期和重复的应用：为了抑制肿瘤生长，血管生成抑制因子的使用应持续很长时间直到使用放、化疗和手术的方法使肿瘤组织完全消失。②高剂量的用药：用动物实验的数据来推算，以endostatin为例，要使体重60kg的患者达到完全的抗肿瘤效果的用量至少需用1000-1200mg·d-1。③药物的毒性：尽管内源性血管生成抑制因子对人体没有毒性，但是用于临床的可大量生产的抑制因子都是用微生物诱导表达的重组蛋白。这些重组蛋白可能会有毒性或携带转染因子，尤其是当使用剂量很大时。此外，外源性蛋白应用于人体时还可能产生有害性免疫应答。④高昂的费用：目前，由于受生产工艺的制约，长期的大剂量使用重组蛋白治疗肿瘤将会给患者带来沉重的经济负担。
6抗血管生成的基因治疗
目前已开展的200多个临床基因治疗试验约有一半是针对于癌症治疗的[28]，而这一半的基因疗法又都是针对肿瘤细胞的。这些方法都是向肿瘤细胞导入基因，其目的在于：①阻滞肿瘤细胞患者周期；②诱导肿瘤细胞凋亡；③表达抑制肿瘤细胞生长的分子；④修正基因突变；⑤增强宿主对于肿瘤细胞的免疫应答；⑥增强肿瘤细胞对药物的敏感性。由于肿瘤细胞基因遗传的不稳定性，上述方法要应用于临床仍有一些困难，其中最主要的是肿瘤细胞的异质性，导致用于基因治疗的质粒不能有效扩散及表达。而抑制血管生成的基因治疗直接针对遗传上相对稳定的内皮细胞，克服了上述缺点。与使用抑制因子治疗不同的是，抑制血管生成的基因治疗不必注射大剂量的dna分子，基因载体的改进使得导入的基因能在人体内稳定地表达数月或数年之久。此外，生产基因治疗载体要比制造大量高纯度的蛋白质容易和便宜很多。当前，已有几种抗血管基因治疗载体用于临床治疗肿瘤如endostatin基因载体[29]。已得出的数据显示：这些基因治疗在肿瘤耐受性动物体内产生了预期的抗肿瘤效果。
7回顾与展望
综上所述，血管生成抑制因子在治疗实体瘤上确实有诸多优点：不易产生抗药性，可抑制肿瘤转移；但是应用于临床仍然有很多缺点需要克服。为了增加治疗效果，可考虑以下几点改进方法：①联合治疗：可与化疗、放疗、免疫治疗等联合使用；几种血管生成抑制因子合用，减少单独使用时的剂量和毒性。②寻找并鉴定更多强效的血管生成抑制因子。③延长抑制因子体内半衰期：使得血管生成抑制因子在低剂量和少数几次给药后即可在体内达到稳定有效的抑肿瘤细胞浓度。④靶向治疗：利用生物技术靶向导入血管生成抑制因子，使其与肿瘤细胞或血管内皮细胞表面受体特异性结合，以增加肿瘤病灶局部的血管生成抑制因子浓度，达到治疗效果。⑤基因疗法：通过构建高表达的真核载体，并将其导入到合适的机体组织中，使相应的基因表达产物直接作用于病灶。其优点在于低剂量使用，注射次数少，费用低廉。
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